Laboratorio di biologia/ELISA

Questa è una tecnica molto versatile in cui grazie agli anticorpi e ad una oculata scelta di controlli positivi e negativi è possibile ricavare un numero notevole di informazioni anche in maniera semiquantitativa. Ci sono molti tipi di elisa chiamati con diversi nomi che indicano differenze nel costrutto utilizzato. Iniziamo qui a vedere i principi generali del processo per poi chiarire le varianti.

Il nucleo della tecnica è il costrutto anticorpo antigene ovvero l'unione di un antigene con un anticorpo e con un secondo anticorpo coniugato con un sistema rivelatore analizzato in seguito. La seconda nozione di base è la capacità del Polipropilene di formare legami con le proteine.

Alla specificità del legame antigene anticorpo si unisce la sensibilità dello sviluppo tramite reazione enzimatica.

Attualmente in commercio esistono innumerevoli kit già pronti per svariate applicazioni nel campo della diagnostica molecolare in cui l'unica cosa che manca è il campione da analizzare. Questi kit fondamentali in diagnostica per la velocità e la riproducibilità della misura risultano poco pratici nel campo della ricerca per la poca flessibilità. Per usare questi kit conviene leggere il libretto di istruzioni.

Di seguito sarà descritta la tecnica per ottenere un sistema completo.

Materiale

• Piastre di Polipropilene, vinile o trattate specificamente per ELISA da 96 o 124 pozzetti a fondo curvo o piatto (migliore per le letture spettrofotometriche)
• Tamponi:

1. tampone fosfato 0,1 M pH 9 oppure Tampone citrato-carbonato pH 8,5-9 oppure carbonato 0,1M ph 9,6
2. PBS pH 7.2 o 7,4 + 0,5 - 1% w/w Albumina bovina
3. PBS + 0,05% np-40 (oppure per proteine di membrana usare 1% Np-40)

• Proteina 1, ovvero l'Antigene o l'Anticorpo purificato
• Campione da analizzare
• anticorpo primario
• anticorpo secondario coniugato con Alp o HRP
• Soluzione del substrato specifico per l'enzima

Procedimento

"Stratificazione" prima proteina

Nell'ELISA classico in cui si vogliono rivelare anticorpi specifici contro n determinato antigene la prima proteina è appunto tale antigene purificato o una miscela di antigeni (virali o batterici ad esempio). Nell'ELISA "Sandwich" invece la prima proteina ad essere stratificata è l'anticorpo (preferibilmente monoclonale) contro un antigene da rivelare.

L'adesione della proteina al polimero plastico è favorita da un pH basico tra 8 e 10 ed avviene in 4-5 ore a 37 °C e in 16-24 h a 4 °C. Se si tratta di polipeptidi o proteine che hanno un peso molecolare fino a 20 -30 kDa si possono diluire nel tampone 1 mentre per proteine più pesanti e quindi anche per gli anticorpi conviene usare un tampone contenente lo 0.1% di BSA che impedisce che le proteine aderiscano completamente alla piastra rendendo poco accessibili. Nella figura è riportato l'esempio dell'anticorpo.

Schema della differenza tra la piastra coperta con albumina e quella no

Quindi per effettuare la stratificazione

• diluire la proteina nel tampone 1 fino ad una concentrazione di che può andare da 5 μg/ml (proteine leggere) a 20 μg/ml (proteine pesanti).
• riempire circa 1/5 della capacità del pozzetto
• incubare alla temperatura desiderata per il tempo indicato
• lavare con tampone 2 per 2 volte
• riempire il pozzetto completamente col tampone 2 ed incubare per 2 ore a temperatura ambiente
• Lavare 3 volte con tampone 3