Laboratorio di biologia/Conta cellulare spettrofotometrica

Spesso si rivela necessario in alcuni esperimenti determinare in maniera quantitativa la quantità di cellule aderenti ad una piastra di coltura prima e dopo un esperimento. Sono stati proposti molti metodi colorimerici, uno di rapida esecuzione, effettuabile con materiali di facile reperimento, è il test con il cristal violetto un colorante idrosolubile con affinità per il DNA a ph neutro, solubile a ph acido.

MaterialiModifica

  • Fissante: formalina tamponata al 4% o 10%, oppure metanolo assoluto
  • Cristalvioletto (in cristalli o in soluzione) da portare ad una concentrazione di 0,1-0,3% w/w in acqua distillata
  • Acido acetico 30% v/v
  • Spettrofotometro che lavori nel visibile

ProceduraModifica

  • Lavare 2-3 volte le cellule con PBS
  • Aggiungere il fissante in quantità tale da coprire le cellule per 1-2 mm
    • Incubare per 30 min
  • Lavare con acqua distillata 2 volte
  • Aggiungere La soluzione di cristal violetto nella stessa quantità dl fissante
    • incubare 30 min
  • Lavare 4-5 volte (fino a quando l'acqua del lavaggio sia trasparente)
  • Aggiungere la soluzione di ac. Acetico nelle quantità del fissante ed attendere fino a completa dissoluzione del colorante, agitando
  • Leggere con lo spettrofotometro a 595 nm

Se la lettura è fuori scala diluire in maniera uguale o proporzionale la soluzione colorata con altro acido acetico

Scelta dei riferimentiModifica

Il metodo fornisce una valutazione relativa, data dal rapporto (assorbanza supporto test) / (assorbanza controllo negativo). Quindi bisogna mantenere come sempre un controllo negativo che può essere una piastra lavata o incubata con pbs (con o senza ioni bivalenti) nel caso si debba valutare il distacco cellulare; una piastra non trattata o trattata con BSA (Bovine serum albumin) come controllo negativo in un esperimento di adesione cellulare.