Laboratorio di biologia/Appendice 2

Tamponi

In questa pagina sono raccolte le ricette per la preparazione dei tamponi base da usare nella pratica di laboratorio. Le quantità sono intese per la preparazione di 1 litro di soluzione 1x pronta all'uso, eccetto dove viene specificato altrimenti. Per ottenere soluzioni madre più concentrate adatte allo stoccaggio si moltiplicano le quantità o si diminuisce il volume di un fattore 5 o 10 o 20 per rendere difficoltosa la crescita di muffe nel liquido. nelle soluzioni madre conviene aggiungere sodio azide alla concentrazionefinale dello 0.05% p/p eccetto nelle soluzioni destinate all'uso di perossidasi in quanto verrebbero inattivate dal conservante.

Come aqua di diluizione si può scegliere tra acqua distillata, bidistillata o milli-q a seconda dell'utilizzo.

PBS

Preparazione del PBS (Phopsphate buffered saline, soluzione salina tamponata con fosfato). Questa soluzione può essere usata per la lavorazione con cellule.

Quantità per 1 litro di soluzione 1x o 20x:

	Conc	1x	20 x
Cloruro di sodio	0,137 M	8,0 g	160,0 g
Cloruro di potassio	0,0027 M	0,2 g	4 g
diSodio idrogenofosfato	0,008 M	1,15 g	23,0 g
Potassio diidrogenofosfato	0,00015 M	0,02 g	0,4 g
pH	7,2-7,4

Se necessario si può aggiungere EDTA nella quantità di 0,2 g/L del sale disodico.

PBS per lisi cellulare

È una soluzione ipotonica con aggiunta di un tensioattivo come il TritonX-100 o il Nonidet P-40 e di antiproteasi e se si desidera dell'ortovanadato come antifosfatasi. { un tampone di lisi estremamente blando conviene usare un sonicatore, altrimenti il materiale proteico estratto può essere molto poco.

	conc	1x	20 x
Cloruro di sodio	0,01 M	0,585 g	11,7 g
Cloruro di potassio	0,0002 M	0,015 g	0,3 g
diSodio idrogenofosfato	0,008 M	1,15 g	23 g
Potassio diidrogenofosfato	0,00015 M	0,02g	0,4 g
EDTA	0,2 g
pH	7,2-7,4

RIPA

Massima concentrazione preparabile è 5x in cui comunque crescono le muffe anche se tenuto a +4 gradi, prepararne 100 mL alla volta.L'SDS e il Desossicolato sono opzionali, sono utili per una estrazione totale delle proteine anche dal nucleo ma possono interferire con l'interazione proteina-proteina.

	conc	1x 1 L	5x 100 mL
Cloruro di sodio	0,150 M	8,78 g	4,39 g
Nonidet P-40	1% v/v	10 mL	5 mL
Sodio desossicolato	0.1 g/100 mL	1 g	0,5 g
SDS	0,1%	1 g	0,5 g
Tris idrocloruro	50 mM	6,06 g	3,03 g
EDTA	5 mM	1,86 g	0,93 g
pH	8,0

Tris buffered saline

	conc	1x 1 L	10x 1 L
Cloruro di sodio	0,150 M	8,8 g	88,0 g
Tris base	50 mM	6,1 g	61,0 g
EDTA (acido)	5 mM	1,5 g	15,0 g
Nonidet P-40	1% v/v	10 mL	(100 mL)
pH	7.4

L' EDTA e Np-40 servono se si desidera usare il tampone come lisante cellulare (circa 1 mL per milione di cellule). Può essere aggiunto al posto dell' NP-40 anche il Triton-X o il Tween-20. Nella pratica di laboratorio è difficile che serva lisare tante cellule da preparare 1 litro di 10x con NP-40, questo può essere aggiunto al tampone base all'occorrenza, perché non altera in maniera significativa il pH.

Tampone carbonato-citrato

Tampone basico per ELISA o per colonne di purificazione aminolink. La sua preparazione è un po' più complessa degli altri tamponi per la presenza del carbonato che in ambiente acido diventa CO₂. Una volta pesate le polveri procedere in questo modo:

• unire in metà del volume finale il Cloruro di sodio con l'acido citrico o il citrato di sodio
• portare approssimativamente a pH 7
  • Attenti, dopo pH 6 il tampone provvisorio tende per piccole aggiunte a schizzare a ph molto basici
• Aggiungere in agitazione il carbonato di sodio poco alla volta
• Aggiustare il pH con HCl
  • usare HCl poco concentrato e mantenere la sol in agitazione specialmente nella preparazione del 10x

	Conc	1x	10 x
Cloruro di sodio	0,137 M	8,0 g	80,0 g
Acido citrico anidro	0,010 M	2,94 g	29,4 g
Carbonato di sodio	0,010 M	1,06 g	10,6 g
pH	8,5-9

Consiglio di preparare la soluzione 1x all'occorrenza, 10-15 mL per una piastra da 96 pozzetti, perché nell'arco di un paio di settimane il tampone altera la sua concentrazione di carbonato.