Laboratorio di biologia/Immunostaining

Indice del libro


Questa tecnica si usa per visualizzare in quali zone della sezione di tessuto si trovano determinati antigeni, per far questo si usano gli anticorpi.


MaterialiModifica

  • vetrino con una sezione non colorata
  • vetrino coprioggetto
  • un supporto per vetrini con manico lungo almeno 5-10 cm
  • 8 vaschette di vetro la cui dimensione sia compatibile con quella del portavetrini
    • 6 di queste andranno a formare la scala di idratazione/deidratazione e colorazione una per l'ematossilina e un'altra (preferibilmente in pirex) sarà usata per i passaggi di lavoro.
  • Pipettatrice tipo gilson da 200 microlitri
  • xilene, 2 vaschette
  • etanolo assoluto, 2 vaschette
  • etanolo 90°, 2 vaschette
  • Emallume di Mayer (Ematossilina)
  • acqua distillata 2 litri
  • tampone citrato per IIC
  • Soluzione di perossido di idrogeno al 3%
  • PBS tampone fosfato in soluzione salina
  • Siero di cavallo
  • Anticorpo primario
  • Anticorpo secondario coniugato con HRP
  • Soluzione di diamminobenzidina DAB in tampone di reazione
  • Montante per vetrini

ProtocolloModifica

IdratazioneModifica

Mettere il vetrino in stufa 60 °C fino a quando la paraffina non è diventata liquida.

Dopodiché si immerge:

  1. 20 minuti in xilene 1
  2. 15 min in xilene 2
  3. 10 min in etanolo assoluto 1
  4. 10 min etanolo assoluto 2
  5. 5 min in etanolo 90° 1
  6. 5 min in etanolo 90° 2
  7. 20 min i acqua distillata

Smascheramento antigenicoModifica

Immergere i vetrini in tampone citrato e in tre cicli da 5' in microonde a 700W controllando che il livello dell'acqua copra sempre il vetrino, rabboccando con acqua distillata alla stessa riscaldata in parallelo. Oppure in bagnomaria a 98 °C Una volta finito lasciare raffreddare a temperatura ambiente e lavare 2 volte con acqua distillata.

Inibizione delle perossidasi del campioneModifica

Mettere a bagno i vetrini con la soluzione di H2O2 per 20 min al buio. Sciacquare con acqua distillata

Anticorpo primarioModifica

I successivi 3 passaggi vanno effettuati in camera umida.

Lavare con PBS (tampone fosfato) e depositare, dopo aver cerchiato le sezioni con la PAP pen, siero di cavallo diluito 1:100 v/v con PBS. Togliere il liquido con carta assorbnte e depositare uniformemente la soluzione dell'anticorpo primario da lasciare per 1 ora al buio. Lavare 3 volte in PBS.

Anticorpo secondarioModifica

Cospargere i campioni con una soluzione di anticorpo secondario perossidato e lasciare agire per 20 min al buio. Lavare per tre volte con pbs

SviluppoModifica

Aggiungere la soluzione di DAB (manipolare con cautela, è cancerogeno!) a lasciare 7 min al buio, neutralizzare le rimanenze e le gocce cadute al di fuori del vetrino con ipoclorito di sodio concentrato, che non deve toccare assolutamente i vetrini

Dopodiché sciacquare i vetrini in flusso di acqua di corrente, per 5 min.

Contro colorazioneModifica

  1. Lavare in acqua distillata per 5 min
  2. Passare, agitando, i vetrini nella soluzione di ematossilina per al massimo 20 sec.
  3. sciacquare in acqua distillata agitando delicatamente
  4. virare in acqua di rubinetto per 4 minuti fino a quando il colorante vira da rosso a viola
  5. sciacquare in acqua distillata per 5 min

Disidratazione e montaggioModifica

Eseguire al contrario i passaggi di cui al punto primo (idratazione)

Cospargere il vetrino con un poco di montante.

Montare il vetrino coprioggetto e fare asciugare in stufa.

RisultatoModifica

 

Questa e l'mmagine di un carcinoma mammario colorato per il recettore per gli estrogeni. La diamminobenzidina che ha reagito si colora in marrone e quindi le aree marroni della sezione sono quelle dove è presente l'antigene.