Laboratorio di biologia/Appendice 2

Indice del libro

TamponiModifica

In questa pagina sono raccolte le ricette per la preparazione dei tamponi base da usare nella pratica di laboratorio. Le quantità sono intese per la preparazione di 1 litro di soluzione 1x pronta all'uso, eccetto dove viene specificato altrimenti. Per ottenere soluzioni madre più concentrate adatte allo stoccaggio si moltiplicano le quantità o si diminuisce il volume di un fattore 5 o 10 o 20 per rendere difficoltosa la crescita di muffe nel liquido. nelle soluzioni madre conviene aggiungere sodio azide alla concentrazionefinale dello 0.05% p/p eccetto nelle soluzioni destinate all'uso di perossidasi in quanto verrebbero inattivate dal conservante.

Come aqua di diluizione si può scegliere tra acqua distillata, bidistillata o milli-q a seconda dell'utilizzo.

PBSModifica

Preparazione del PBS (Phopsphate buffered saline, soluzione salina tamponata con fosfato). Questa soluzione può essere usata per la lavorazione con cellule.

Quantità per 1 litro di soluzione 1x o 20x:

Conc 1x 20 x
Cloruro di sodio 0,137 M 8,0 g 160,0 g
Cloruro di potassio 0,0027 M 0,2 g 4 g
diSodio idrogenofosfato 0,008 M 1,15 g 23,0 g
Potassio diidrogenofosfato 0,00015 M 0,02 g 0,4 g
pH 7,2-7,4

Se necessario si può aggiungere EDTA nella quantità di 0,2 g/L del sale disodico.

PBS per lisi cellulareModifica

È una soluzione ipotonica con aggiunta di un tensioattivo come il TritonX-100 o il Nonidet P-40 e di antiproteasi e se si desidera dell'ortovanadato come antifosfatasi. { un tampone di lisi estremamente blando conviene usare un sonicatore, altrimenti il materiale proteico estratto può essere molto poco.

conc 1x 20 x
Cloruro di sodio 0,01 M 0,585 g 11,7 g
Cloruro di potassio 0,0002 M 0,015 g 0,3 g
diSodio idrogenofosfato 0,008 M 1,15 g 23 g
Potassio diidrogenofosfato 0,00015 M 0,02g 0,4 g
EDTA 0,2 g
pH 7,2-7,4

RIPAModifica

Massima concentrazione preparabile è 5x in cui comunque crescono le muffe anche se tenuto a +4 gradi, prepararne 100 mL alla volta.L'SDS e il Desossicolato sono opzionali, sono utili per una estrazione totale delle proteine anche dal nucleo ma possono interferire con l'interazione proteina-proteina.

conc 1x 1 L 5x 100 mL
Cloruro di sodio 0,150 M 8,78 g 4,39 g
Nonidet P-40 1% v/v 10 mL 5 mL
Sodio desossicolato 0.1 g/100 mL 1 g 0,5 g
SDS 0,1% 1 g 0,5 g
Tris idrocloruro 50 mM 6,06 g 3,03 g
EDTA 5 mM 1,86 g 0,93 g
pH 8,0

Tris buffered salineModifica

conc 1x 1 L 10x 1 L
Cloruro di sodio 0,150 M 8,8 g 88,0 g
Tris base 50 mM 6,1 g 61,0 g
EDTA (acido) 5 mM 1,5 g 15,0 g
Nonidet P-40 1% v/v 10 mL (100 mL)
pH 7.4

L' EDTA e Np-40 servono se si desidera usare il tampone come lisante cellulare (circa 1 mL per milione di cellule). Può essere aggiunto al posto dell' NP-40 anche il Triton-X o il Tween-20. Nella pratica di laboratorio è difficile che serva lisare tante cellule da preparare 1 litro di 10x con NP-40, questo può essere aggiunto al tampone base all'occorrenza, perché non altera in maniera significativa il pH.

Tampone carbonato-citratoModifica

Tampone basico per ELISA o per colonne di purificazione aminolink. La sua preparazione è un po' più complessa degli altri tamponi per la presenza del carbonato che in ambiente acido diventa CO2. Una volta pesate le polveri procedere in questo modo:

  • unire in metà del volume finale il Cloruro di sodio con l'acido citrico o il citrato di sodio
  • portare approssimativamente a pH 7
    • Attenti, dopo pH 6 il tampone provvisorio tende per piccole aggiunte a schizzare a ph molto basici
  • Aggiungere in agitazione il carbonato di sodio poco alla volta
  • Aggiustare il pH con HCl
    • usare HCl poco concentrato e mantenere la sol in agitazione specialmente nella preparazione del 10x
Conc 1x 10 x
Cloruro di sodio 0,137 M 8,0 g 80,0 g
Acido citrico anidro 0,010 M 2,94 g 29,4 g
Carbonato di sodio 0,010 M 1,06 g 10,6 g
pH 8,5-9

Consiglio di preparare la soluzione 1x all'occorrenza, 10-15 mL per una piastra da 96 pozzetti, perché nell'arco di un paio di settimane il tampone altera la sua concentrazione di carbonato.