Laboratorio di biologia/Immunostaining

Questa tecnica si usa per visualizzare in quali zone della sezione di tessuto si trovano determinati antigeni, per far questo si usano gli anticorpi.

Materiali

• vetrino con una sezione non colorata
• vetrino coprioggetto
• un supporto per vetrini con manico lungo almeno 5-10 cm
• 8 vaschette di vetro la cui dimensione sia compatibile con quella del portavetrini
  • 6 di queste andranno a formare la scala di idratazione/deidratazione e colorazione una per l'ematossilina e un'altra (preferibilmente in pirex) sarà usata per i passaggi di lavoro.
• Pipettatrice tipo gilson da 200 microlitri
• xilene, 2 vaschette
• etanolo assoluto, 2 vaschette
• etanolo 90°, 2 vaschette
• Emallume di Mayer (Ematossilina)
• acqua distillata 2 litri
• tampone citrato per IIC
• Soluzione di perossido di idrogeno al 3%
• PBS tampone fosfato in soluzione salina
• Siero di cavallo
• Anticorpo primario
• Anticorpo secondario coniugato con HRP
• Soluzione di diamminobenzidina DAB in tampone di reazione
• Montante per vetrini

Protocollo

Idratazione

Mettere il vetrino in stufa 60 °C fino a quando la paraffina non è diventata liquida.

Dopodiché si immerge:

1. 20 minuti in xilene 1
2. 15 min in xilene 2
3. 10 min in etanolo assoluto 1
4. 10 min etanolo assoluto 2
5. 5 min in etanolo 90° 1
6. 5 min in etanolo 90° 2
7. 20 min i acqua distillata

Smascheramento antigenico

Immergere i vetrini in tampone citrato e in tre cicli da 5' in microonde a 700W controllando che il livello dell'acqua copra sempre il vetrino, rabboccando con acqua distillata alla stessa riscaldata in parallelo. Oppure in bagnomaria a 98 °C Una volta finito lasciare raffreddare a temperatura ambiente e lavare 2 volte con acqua distillata.

Inibizione delle perossidasi del campione

Mettere a bagno i vetrini con la soluzione di H₂O₂ per 20 min al buio. Sciacquare con acqua distillata

Anticorpo primario

I successivi 3 passaggi vanno effettuati in camera umida.

Lavare con PBS (tampone fosfato) e depositare, dopo aver cerchiato le sezioni con la PAP pen, siero di cavallo diluito 1:100 v/v con PBS. Togliere il liquido con carta assorbnte e depositare uniformemente la soluzione dell'anticorpo primario da lasciare per 1 ora al buio. Lavare 3 volte in PBS.

Anticorpo secondario

Cospargere i campioni con una soluzione di anticorpo secondario perossidato e lasciare agire per 20 min al buio. Lavare per tre volte con pbs

Sviluppo

Aggiungere la soluzione di DAB (manipolare con cautela, è cancerogeno!) a lasciare 7 min al buio, neutralizzare le rimanenze e le gocce cadute al di fuori del vetrino con ipoclorito di sodio concentrato, che non deve toccare assolutamente i vetrini

Dopodiché sciacquare i vetrini in flusso di acqua di corrente, per 5 min.

Contro colorazione

1. Lavare in acqua distillata per 5 min
2. Passare, agitando, i vetrini nella soluzione di ematossilina per al massimo 20 sec.
3. sciacquare in acqua distillata agitando delicatamente
4. virare in acqua di rubinetto per 4 minuti fino a quando il colorante vira da rosso a viola
5. sciacquare in acqua distillata per 5 min

Disidratazione e montaggio

Eseguire al contrario i passaggi di cui al punto primo (idratazione)

Cospargere il vetrino con un poco di montante.

Montare il vetrino coprioggetto e fare asciugare in stufa.

Risultato

Questa e l'mmagine di un carcinoma mammario colorato per il recettore per gli estrogeni. La diamminobenzidina che ha reagito si colora in marrone e quindi le aree marroni della sezione sono quelle dove è presente l'antigene.