Utente:R5b43/Saggio immunologico
Western blotting modifica
Il western blotting è una tecnica analitica ampiamente usata per rilevare specifiche proteine in un campione. Usa l'elettroforesi su gel per separare le proteine sfruttando la loro struttura tridimensionale, o proteine denaturate in base alla lunghezza del polipeptide. Le proteine sono quindi trasferite in una membrana (solitamente nitrocellulosa o PVDF), dove sono evidenziate con anticorpi specifici alla proteina di interesse. L'elettroforesi è inclusa nella tecnica del Western blotting per risolvere il problema della reattività tra gli anticorpi. Alcuni motori di ricerca, come CiteAb, possono aiutare i ricercatori a trovare anticorpi adatti al Western blotting.
Il nome western blotting è formato sul southern blotting, una tecnica di assorbimento del DNA sviluppata da Edwin Southern. L'assorbimento del RNA si chiama northern blotting.
Elettroforesi modifica
Le proteine del campione sono separate coll'elettroforesi su gel. La separazione delle proteine può essere compiuta mediante il punto isoelettrico, massa molecolare, carica elettrica, o una combinazione di questi fattori. SDS-PAGE è di gran lunga il tipo più comune e di elettroforesi. È anche possibile usare un'elettroforesi su gel bidimensionale.
Trasferimento modifica
Per far sì che le proteine possano essere soggette all'azione degli anticorpi, esse sono trasferite dal gel in una membrana di nitrocellulosa o polivinilidenfluoruro (PVDF). Il metodo per trasferire le proteine è detto electroblotting e sfrutta un campo elettrico per far migrare le proteine dal gel alla membrana. Successivamente le proteine sono esposte su su una superficie sottile per assorbimento (vedi sotto). Le membrane usate per il trasferimento hanno la peculiarità di legare allo stesso modo le proteine. Il legame colle proteine è basato su interazioni idrofobiche, e anche su interazioni elettrostatiche tra la membrana e le proteine. Le membrane di nitrocellulosa sono meno costose del PVDF, ma sono molto più fragili e non resistono a saggi ripetuti.
L'uniformità e soprattutto la riuscita del trasferimento delle proteine dal gel alla membrana può essere controllata colorando la membrana con blu di Coomassie o con il rosso di Ponceau. Quest'ultimo è più comune, grazie alle sue maggiori sensibilità e solubilità in acqua, la quale rende più facile decolorare e saggiare la membrana, come descritto sotto.
Bloccaggio modifica
Poiché la membrana è scelta per la sua capacità di legare le proteine, occorre prevenire legami tra la membrana e l'anticorpo impiegato per il rilevamento della proteina di interesse. L'inibizione dei legami è ottenuta mettendo la membrana in una una soluzione diluita proteica - tipicamente 3-5% albumina di siero bovina o latte scremato in polvere in TBS o I-Block, con una piccola percentuale (0,1%) di detergente come Tween 20 o Triton X-100. La proteina della soluzione diluita si lega alla membrana in tutti i punti in cui le proteine non si sono legate. Quindi, quando si aggiunge l'anticorpo, questo non potrà attaccarsi a nessuno spazio della membrana eccetto i siti di legame della proteina di interesse, eliminando i falsi positivi.
Rilevamento modifica
Durante la fase di rilevamento la membrana è saggiata per la proteina di interesse con un anticorpo modificato che è legato a un enzima reporter. Se esposto a un appropriato substrato, questo enzima causa una reazione colorimetrica e produce un colore. Per diverse ragioni, ciò tradizionalmente si sviluppa in due fasi, benché esistano rilevamenti di una sola fase per certe applicazioni.
Nel processo a due fasi, una soluzione diluita dell'anticorpo primario (generalmente tra 0,5 e 5 mg/mL) è incubata colla membrana cui segue una blanda agitazione. Tipicamente, la soluzione è composta di una soluzione tampone salina con una piccola percentuale di detergente, e a volte con latte in polvere o BSA. La soluzione e la membrana possono essere sigillati e incubati assieme da 30 minuti a tutta la notte. Possono essere incubati anche a differenti temperature, con le temperature più alte associate a legami più forti sia specifici (colla proteina di interesse, il "segnale") che aspecifici ("rumore").
Dopo aver risciacquato la membrana per rimuovere gli anticorpi primari non legatisi, la membrana è esposta a un altro anticorpo, diretto a una porzione specifica dell'anticorpo primario. Gli anticorpi provengono da fonti animali. Un anticorpo secondario anti-topo si legherà a quasi ogni anticorpo primario proveniente dal topo. L'anticorpo secondario è solitamente legato alla biotina o a un enzima reporter come la fosfotasi alcalina o la perossidasi di rafano. Ciò significa che numerosi anticorpi secondari si legheranno all'anticorpo primario e incrementeranno il segnale.
Più comunemente, una perossidasi di rafano legata all'anticorpo secondario è usata per rompere un agente chemioluminescente, e la reazione produce luminescenza in proporzione alla quantità di proteine. Una pellicola fotografica sensibile è posta contro la membrana e l'esposizione alla luce crea un'immagine degli anticorpi legato al blot. Un metodo più economico ma meno sensibile impiega il colorante 4-cloronaftolo all'1% di perossido di idrogeno; la reazione dei radicali di perossido col 4-cloronaftolo produce un colore porpora scuro che produce una fotografia senza l'uso di pellicole specifiche.