Laboratorio di biologia/Western blot: differenze tra le versioni
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===Preparazione della membrana e deposizione anticorpi===
#Versare circa 20 ml di soluzione di [[w:Rosso Ponceau|Rosso Ponceau]] (soluzione allo 0,1%, in acido acetico 1%) nella vaschetta messa su un agitatore oscillante per 5 min
#*Questo passaggio serve per valutare l'efficienza del trasferimento, la presenza di bolle, evidenziare l'area di lavoro e le [[Wikt:lane|lane]]s corse. Queste informazioni sono utili per tagliare la membrana e ridefinire l'area utile, separare le varie lanes o verticalmente o orizzontalmente, destinando a trattamenti diversi i vari pezzi.
#*E' utile in questo passaggio incidere con un bisturi o taglierino nuovo dei minuscoli triangolini sul bordo della membrana per orientarsi quando la membrana sarà totalmente bianca: sul bordo alto in corrispondenza dei bordi delle singole lanes; Sul bordo prossimo ai
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▲#*E' utile in questo passaggio incidere con un bisturi o taglierino nuovo dei minuscoli triangolini sul bordo della membrana per orientarsi quando la membrana sarà totalmente bianca: sul bordo alto in corrispondenza dei bordi delle singole lanes; Sul bordo prossimo ai persi molecolari, in corrispondenza delle bande. Conviene inoltre tagliare una porzione dell'angolo in basso a sinistra (le due facce della membrana non sono uguali).
#Opzionalmente si può colorare anche il gel di poliacrilamide residuo in
▲#*Ora è cosigliabile disegnare sul foglio provvisorio dell'espermento la forma della membrana la posizione dei triangolini con i numeri delle lanes e dei pesi molecolari e dell'angolo tagliato, i le bande più evidenti alla colorazione con il rosso, eventuali bolle e da ultima la cosa più importante: le linee secondo cui si è tagliata la membrana associando una lettera ad ogni pezzo.
#Per eliminare il rosso ponceau, utilizzare un piccolo volume (circa 10 ml) della soluzione tampone in cui verrà incubato l'anticorpo.
▲#Opzionalmente si può colorare anche il gel di poliacrilamide residuo in comassie blu per verificare le proteine residue.
#Una volta decolorata aggiungere in sequenza i seguenti tamponi in modo tale che il loro livello sia meno di 1 mm superiore della superficie della membrana (prendere nota di tale volume), continuando ad agitare:
## NET-Gelatina 0,2% per 1 ora (opzionale, è preferibile nel caso si debbano visualizzare proteine poco espresse perché abbassa notevolmente il disturbo di fondo)
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#Preparare una soluzione di anticorpo primario nel volume di NET annotato nel passaggio precedente.
#*La concentrazione dell'anticorpo viene spesso indicata dalla casa produttrice solitamente 10 μg/ml per i monoclonali 10 volte di meno per i policlonali, tuttavia conviene effettuare dei western di prova per calibrare la quantità come indicato nel paragrafo apposito.
#Incubare per almeno 1 ora poi recuperare e conservare aggiungendo lo 0,02% di [[w:Azoturo di sodio|Azoturo di sodio]] in modo da poter essere riutilizzato per 5-10 volte. Anche la durata dell'incubazione va
#Tre cambi di NET di 20 min ciascuno.
#Preparare una soluzione di anticorpo secondario perossidato (solitamente diluito 1:10000)nel volume di NET-Carnation (o gelatina)annotato nel passaggio 5. QUesta soluzione puoò essere usata per 4-5 volte, a patto di non superare i 5 giorni di conservazione.
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