Laboratorio di biologia/Western blot: differenze tra le versioni
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==Protocollo==
===Trasferimento===
#Si parte da un [[Laboratorio/SDS-PAGE|gel di poliacrilamide]] su cui hanno corso delle proteine, lo si estrae dal supporto, si taglia via la parte dello stacking gel e lo si immerge nel transfer buffer per 15 minuti.
#Si immergono nello stesso tampone i due supporti spugnosi, i due rettangoli di carta assorbente e la membrana di trasferimento lasciando anche questi per lo stesso tempo.▼
#Si predispone poi il Sandwich di trasferimento nella cassettina in questo ordine partendo dal lato che sarà rivolto verso l'anodo (-):▼
▲#Si immergono nello stesso tampone i due supporti spugnosi, i due rettangoli di carta assorbente e la membrana di trasferimento.
▲#Si predispone poi il Sandwich di trasferimento nella cassettina in questo ordine partendo dal lato che sarà rivolto verso l'anodo:
#*Spugna
#*Carta
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#*Carta
#*Spugna
#**Prima di porre il secondo strato di carta eliminare le bolle d'aria tra la membrana e il gel con un rullo (o una pipetta) bagnati di tampone.
#Chiudere la cassettina
#Riempire l'apparato con il transfer buffer
#Introdurre nei binari la cassettina preparata avendo cura di rispettare le polarità, è importante infatti rivolgere la membrana di nitrocellulosa verso ilpolo positivo, in questa operazione è importante non fare errori, tutto l'esperimento può essere vanificato.
#Collegare gli elettrodi all'alimentatore selezionando l'opzione voltaggio costante ed impostando su 50 volt per due ore (nel caso sia necessario trasferire proteine fino a 60 KD) oppure 12 ore per proteine sopra i 100 KD. Se la cella può alloggiare un cubo di ghiaccio sintetico si possono selezionare 100-130 V ed abbrviare i tempi fino a 3-4 ore a seconda delle necessità
#Terminato il processo, separare la membrana ponendola in un contenitore di dimensioni appena maggiori che non abbia irregolarità sul fondo.
===Preparazione della membrana e deposizione anticorpi===
#Versare circa 20 ml di soluzione di [[w:Rosso Ponceau|Rosso Ponceau]] (soluzione allo 0,1%, in acido acetico 1%)nella vaschetta messa su un agitatore oscillante per 5 min, recuperare il colorante che può essere riusato per un centinaio di volte, e decolorare con acqua distillata fino a quando non siano visibili le bande.
#*Questo passaggio serve per valutare l'efficienza del trasferimento, la presenza di bolle, evidenziare l'area di lavoro e le [[Wikt:lane|lane]]s corse.
#Con queste informazioni si può tagliare la membrana per ridefinire l'area utile, separare le varie lanes o verticalmente o orizzontalmente, destinando a trattamenti diversi i vari pezzi.
#*E' utile in questo passaggio incidere con un bisturi o taglierino nuovo dei minuscoli triangolini sul bordo della membrana per orientarsi quando la membrana sarà totalmente bianca: sul bordo alto in corrispondenza dei bordi delle singole lanes; Sul bordo prossimo ai persi molecolari, in corrispondenza delle bande. Conviene inoltre tagliare una porzione dell'angolo in basso a sinistra (le due facce della membrana non sono uguali).
#*Ora è cosigliabile disegnare sul foglio provvisorio dell'espermento la forma della membrana la posizione dei triangolini con i numeri delle lanes e dei pesi molecolari e dell'angolo tagliato, i le bande più evidenti alla colorazione con il rosso, eventuali bolle e da ultima la cosa più importante: le linee secondo cui si è tagliata la membrana associando una lettera ad ogni pezzo.
#Opzionalmente si può colorare anche il gel di poliacrilamide residuo in comassie blu per verificare le proteine residue.
#Decolorare completamente la membrana continuando a lavare con acqua distillata.
#Una volta decolorata aggiungere in sequenza i seguenti tamponi in modo tale che il loro livello sia meno di 1 mm superiore della superficie della membrana (prendere nota di tale volume), continuando ad agitare:
## NET-Gelatina 0,2% per 1 ora (opzionale, è preferibile nel caso si debbano visualizzare proteine poco espresse perchè abbassa notevolmente il disturbo di fondo)
##Tre cambi di NET di 10 min ciascuno
##NET-Carnation 2-5% per 1 ora
##Tre cambi di NET di 10 min ciascuno
#Preparare una soluzione di anticorpo primario nel volume di NET annotato nel passaggio precedente.
#*La concentrazione dell'anticorpo viene spesso indicata dalla casa produttrice solitamente 10 μg/ml per i monoclonali 10 volte di meno per i policlonali, tuttavia conviene effettuare dei western di prova per calibrare la quantità come indicato nel paragrafo apposito.
#Incubare per almeno 1 ora poi recuperare e conservare aggiungendo lo 0,02% di [[w:Azoturo di sodio|Azoturo di sodio]] in modo da poter essere riutilizzato per 5-10 volte. Anche la durata dell'incubazione va detterminata come spiegato infra.
#Tre cambi di NET di 20 min ciascuno.
#Preparare una soluzione di anticorpo secondario perossidato (solitamente diluito 1:10000)nel volume di NET-Carnation (o gelatina)annotato nel passaggio 5. QUesta soluzione puoò essere usata per 4-5 volte, a patto di non superare i 5 giorni di conservazione.
#Tre cambi di NET di 20 min ciascuno.
===Rivelazione===
Viene descritto il procedimento effettuato con substrato chemioluminescente ([[w:ECL|ECL]] o [[w:Luminolo|Luminolo]]) più complesso ma più preciso rispetto ad un sistema basato su un substrato precipitante come [[w:Diamminobenzidina|Diamminobenzidina]].
#Preparare in camera oscura, un volume pari alla metà di quello annotato al punto 5 del precedente sottoparagrafo, di una soluzione composta di un ugual volume dal reagente A e dal reagente B del kit ECL.
#Versarlo nella vaschetta con la membrana e lasciare incubare 2 minuti
#Disporre in una cassetta di sviluppo con interposta un foglio di cellophane la mabrana sgocciolata e una lastra fotografica su cui si è riprodotto il taglio di un angolo che dovrà coincidere perfettamente con quello della membrana
#Sviluppare la lastra secondo le istruzioni fornite dal fornitore
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