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Laboratorio di biologia/Western blot: differenze tra le versioni

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Il '''western blot''' o '''immunofissazione''' è una tecnica [[biochimicaw:immunochimica|immunochimica]] che permette di identificare la presenza di una determinata [[w:proteina|proteina]] in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte diseparate [[anticorpiLaboratorio/SDS-PAGE|elettroforeticamente]] specifici; in generale, per facilitaremediante il riconoscimento lada miscelaparte di proteine viene prima separata in base alle loro dimensioni (o [[peso molecolarew:anticorpo|anticorpi]]) utilizzandospecifici. un gel di [[poliacrilammide]] (maEsistono esistonopoi variazioni quali il dot blot o slot blot, in cui la miscela proteica non viene separata in base alle dimensioni ma ci si affida alla selettivitá antigene/anticorpo); successivamenteper rilevare esclusivamentte la presenza o meno dell'antigene. Successivamente le proteine vengono trasferite su un supporto, che comunemente è una membrana di [[w:nitrocellulosa|nitrocellulosa]], e quindi si procede alalla riconoscimentoreazione veroimmunomediate eed proprioalla dellarivelazione proteina mediante l'utilizzoenzimatica di un anticorpo specificoquesta.
Recentemente sono state messa a punto tecniche che permettono il riconoscimento antigene/anticorpo direttamente nella matrice del gel, quindi evitando il trasferimento su membrana.▼
 
▲Recentemente sono state messamesse a punto tecniche che permettono il riconoscimento antigene/anticorpo direttamente nella matrice del gel, quindi evitando il trasferimento su membrana, ma sono limitate allo screening di poche molecole molto espresse.
Esistono diversi protocolli, ottimizzati a seconda della proteina da identificare, ma si possono individuare le seguenti tappe comuni:
 
Quì di seguito indichiamo un protocollo di base, ottimo per un gran numero di proteine con le diluizioni e i tempi generalmente usati. Nella seconda parte della pagina verrà infatti spiegato come progettare un esperimento per la taratura di queste variabili.
==== Trasferimento su supporto ====▼
In generale si utilizzano supporti di nitrocellulosa; occasionalmente vengono utilizzati supporti di PVDF o nylon. Il gel, dopo la corsa elettroforetica, viene equilibrato in una soluzione [[tampone]] a [[pH]] basico, contenente un agente denaturante quale l'[[SDS]] (sodio dodecilsolfato), con aggiunta di NP40 o Tween 20 opzionale.
 
==== Generalità sul trasferimento====
Il gel viene sistemato su un supporto di carta assorbente imbibita della stessa soluzione tampone; a contatto diretto del gel si sistema la membrana equilibrata con la stessa soluzione, facendo attenzione ad evitare bolle d'aria. Al di sopra della membrana si sistema un ulteriore strato di carta assorbente imbibita della soluzione tampone.
In generale si utilizzano supporti di nitrocellulosa; occasionalmente vengono utilizzati supporti di [[w:PVDF|PVDF]] o nylon.
 
A seconda dell'apparecchio usato, si parla di trasferimento semi-dry (se il tampone è fornito solo dalla carta assorbente) o wet (se il "sandwich" è immerso in una camera contenente soluzione tampone).
 
Il trasferimento avviene applicando una corrente elettrica, con il catodo rivolto verso la membrana di nitrocellulosa in quanto ad un pH basico buona parte delle proteine è carica negativamente. In genere si applicano 0.8 V per centimetro quadrato, per un tempo minimo di 30 minuti ad un massimo di 16 ore, a seconda delle proteine da separare.
 
====Generalità sulla rivelazione====
 
A questo punto, se la proteina è sufficientemente abbondante (per esempio, la [[porina]]), si procede alla rivelazione diretta mediante un anti-anticorpo legato ad un enzima (generalmente l'HRP, perossidasi di rafano). Questo enzima permette la conversione delladi TMBun (tetrametilbenzidina)substrato solubile in un substratouno non solubile, chein precipita instretta prossimita della proteina da rivelare formando un deposito colorato. ▼
Un substrato chemioluminescente che è comunemente usato invece della TMB è il [[w:luminolo|luminolo]]; in tale caso, il segnale deve essere catturato da CCD oppure da una pellicola fotografica. ▼
 
La procedura verrà quindi separata in due parti: il trasferimento delle proteine e la rivelazione. Questa seconda parte è comune con la tecnica del [[Laboratorio/Dot blot|Dot blot]] e con il [[Laboratorio/Lectin blot|Lectin blot]] (con le dovute variazioni che saranno specificate nel testo)▼
 
==Materiali==
 
==Protocollo==
▲==== Trasferimento su supporto ====
 
#Si parte da un [[Laboratorio/SDS-PAGE|gel]] su cui hanno corso delle proteine, lo si estrae dal supporto e lo si immerge nel transfer buffer per 15 minuti.
 
#Si immergono nello stesso tampone i due supporti spugnosi, i due rettangoli di carta assorbente e la membrana di trasferimento.
 
#Si predispone poi il Sandwich di trasferimento nella cassettina in questo ordine partendo dal lato che sarà rivolto verso l'anodo:
#*Spugna
#*Carta
#*Gel
#*Membrana
#*Carta
#*Spugna
 
==== Rivelazione delle proteine ====
Questa si basa sulla elevata affinità di un anticorpo per il suo antigene. In questo caso, l'anticorpo andrà a riconoscere una sequenza amminoacidica della proteina che si intende rivelare.
La membrana di nitrocellulosa viene equilibrata con una soluzione tampone a pH leggermente basico o neutro, in presenza di basse concentrazioni di detergenti, quali l'NP40 o il Tween 20. Questi vengono utilizzati per diminuire la possibilità di interazioni non specifiche fra gli anticorpi e le proteine presenti sulla membrana. Inoltre, la membrana viene saturata con albumina serica di bue al 1-2% o altre proteine, per diminuire il segnale di fondo dovuto al fatto che gli anticorpi sono essi stessi proteine, e si legherebbero alla membrana generando un elevato segnale di fondo.
 
La membrana viene incubata con gli anticorpi per 1-2 ore e poi l'eccesso di anticorpi non legati alla proteina viene accuratamente rimosso mediante successivi lavaggi nella soluzione tampone.
 
▲A questo punto, se la proteina è sufficientemente abbondante (per esempio, la [[porina]]), si procede alla rivelazione diretta mediante un anti-anticorpo legato ad un enzima (generalmente l'HRP, perossidasi di rafano). Questo enzima permette la conversione della TMB (tetrametilbenzidina) in un substrato non solubile, che precipita in prossimita della proteina da rivelare formando un deposito colorato.
▲Un substrato chemioluminescente che è comunemente usato invece della TMB è il luminolo; in tale caso, il segnale deve essere catturato da CCD oppure da una pellicola fotografica.
 
 
▲La procedura verrà quindi separata in due parti: il trasferimento delle proteine e la rivelazione. Questa seconda parte è comune con la tecnica del [[Laboratorio/Dot blot|Dot blot]] e con il [[Laboratorio/Lectin blot|Lectin blot]] (con le dovute variazioni che saranno specificate nel testo)
 
 
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