Laboratorio di biologia/Western blot: differenze tra le versioni
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==== Trasferimento su supporto ====
In generale si utilizzano supporti di nitrocellulosa; occasionalmente vengono utilizzati supporti di nylon. Il gel, dopo la corsa elettroforetica, viene equilibrato in una soluzione [[tampone]] a [[pH]] basico, contenente un agente denaturante quale l'[[SDS]] (sodio dodecilsolfato), con aggiunta di NP40 o Tween 20 opzionale.
Il gel viene sistemato su un supporto di carta assorbente imbibita della stessa soluzione tampone; a contatto diretto del gel si sistema la membrana equilibrata con la stessa soluzione, facendo attenzione ad evitare bolle d'aria. Al di sopra della membrana si sistema un ulteriore strato di carta assorbente imbibita della soluzione tampone.
A seconda dell'apparecchio usato, si parla di trasferimento semi-dry (se il tampone è fornito solo dalla carta assorbente) o wet (se il "sandwich" è immerso in una camera contenente soluzione tampone).
Il trasferimento avviene applicando una corrente elettrica, con il catodo rivolto verso la membrana di nitrocellulosa. In genere si applicano 0.8 V per centimetro quadrato, per un tempo minimo di 30 minuti ad un massimo di 16 ore, a seconda delle proteine da separare.
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Questa si basa sulla elevata affinita di un anticorpo per il suo antigene.
La membrana di nitrocellulosa viene equilibrata con una soluzione tampone a pH leggermente basico o neutro, in presenza di basse concentrazioni di detergenti, quali l'NP40 o il Tween 20. Questi vengono utilizzati per diminuire la possibilita di interazioni non specifiche fra gli anticorpi e le proteine presenti sulla membrana. Inoltre, la membrana viene saturata con albumina serica di bue al 1-2% o altre proteine, per diminuire il segnale di fondo dovuto al fatto che gli anticorpi sono essi stessi proteine, e si legherebbero alla membrana generando un elevato segnale di fondo.
La membrana viene incubata con gli anticorpi per 1-2 ore e poi l'eccesso di anticorpi non legati alla proteina viene accuratamente rimosso mediante successivi lavaggi nella soluzione tampone.
A questo punto, se la proteina è sufficientemente abbondante (per esempio, la [[porina]]), si procede alla rivelazione diretta mediante un anti-anticorpo legato ad un enzima (generalmente l'HRP, perossidasi di rafano). Questo enzima permette la conversione della TMB (tetrametilbenzidina) in un substrato non solubile, che precipita in prossimita della proteina da rivelare formando un deposito colorato
Un substrato chemioluminescente che è comunemente usato invece della TMB è il luminolo; in tale caso, il segnale deve essere catturato da CCD oppure da una pellicola fotografica.
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