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Laboratorio di biologia/Western blot: differenze tra le versioni

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Il '''western blot''' o '''immunofissazione''' è una tecnica [[biochimica]] che permette di identificare una determinata [[proteina]] in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte di [[anticorpi]] specifici; in generale, per facilitare il riconoscimento la miscela di proteine viene prima separata in base alle loro dimensioni (o [[peso molecolare]]) utilizzando un gel di [[poliacrilammide]] (ma esistono variazioni quali il dot blot o slot blot, in cui la miscela proteica non viene separata in base alle dimensioni ma ci si affida alla selettivitá antigene/anticorpo); successivamente le proteine vengono trasferite su un supporto, che comunemente è una membrana di [[nitrocellulosa]], e quindi si procede al riconoscimento vero e proprio della proteina mediante l'utilizzo di un anticorpo specifico.
Il [[w:western blot|western blot]] o immunofissazione consite nell'identificare la presenza di una determinata [[w:proteina|proteina]] su un supporto, che di solito è la [[w:nitrocellulosa|nitrocellulosa]]. Sul supporto sono state precedentemente trasferitele proteine precedentemente corse su di un gel di [[w:poliacrilammide|poliacrilammide]]. Questa tecnica si usa quando il campione corso è composto da una miscela di moltissime proteine tali che con una colorazione standard (blu comassie o nitrato di argento) non si riuscirebbe a distingueerle l'una dall'altra, oppure quando pur avendo bande discrete, la proteina di interesse è in quantità troppo basse per essere visibile con le altre tecniche, infatti il western possiede tre step di amplificazione del segnale e quindi rende visibili anche decimi di picomoli (10<sup>-10</sup>mol) di proteina.
Recentemente sono state messa a punto tecniche che permettono il riconoscimento antigene/anticorpo direttamente nella matrice del gel, quindi evitando il trasferimento su membrana.
 
 
Si usa come tampone base il [[Laboratorio/Appendice 1#NET|NET]] o il [[Laboratorio/Appendice 1#TTBS|TTBS]] o comunque tamponi con pH vicino alla neutralità con piccola percentuale di un detergente (SDS, Tween20, NP-40). Essendo questi equivalenti, Il western blot è una tecnica molto robusta, di seguito la soluzione scelte verrà chiamata semplicemente tampone.
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