Utente:Giuli2797/Cromatografia/Spettrometria di massa e accoppiamento GC-MS: differenze tra le versioni

sigle e correzioni
(note)
(sigle e correzioni)
{{Cromatografia}}
==Spettrometria di massa==
La spettrometria di massa è una tecnica analitica che studia gli ioni in fase gas e che consente di identificare i componenti presenti all'interno di una miscela, determinarne il peso molecolare ed eseguire analisi quantitative. È una tecnica che presenta un'ampia applicabilità grazie alle sue caratteristiche intrinseche: può essere usata su campioni sia organici che inorganici con un intervallo di peso molecolare fino a 10<sup>8</sup> Da, è inoltre estremamente sensibile (fino a 10 <sup>-12</sup> mol/L), è in grado di fornire informazioni sia qualitative che quantitative, per questo motivo le aree di interesse sono estremamente vaste e vanno dalla farmacologia alle scienze ambientali alla biologia e molte altre ancora. Un grande limite legato a questa tecnica è che non è in grado di separare composti diversi, per questo motivo viene infatti accoppiata ad una tecnica separativa come la cromatografia liquida o la gas cromatografiagascromatografia. Ovviamente, essendo differenti le condizioni operative richieste da queste due tecniche bisognerà utilizzare un adeguato sistema di interfaccia che consenta ai due strumenti di lavorare insieme. Questa parte verrà in seguito discussa e meglio approfondita nei capitoli successivi.<br>
 
Il principio che è alla base del funzionamento dello spettrometro di massa vi è la separazione di ioni in fase gas attraverso il loro rapporto massa/carica i quali vengono poi inviati ad un rivelatore che converte l'abbondanza dei singoli ioni in un segnale elettrico.
 
==Sistema di introduzione del campione==
Il campione può essere introdotto sotto diverse forme, può essere allo stato solido, liquido o gas, per questo motivo questa tecnica si presta bene ad essere accoppiata sia con la cromatografia liquida che alla gas cromatografiagascromatografia. Aspetto critico è quello di creare un'interfaccia adeguata che consenta di mantenere l'alto vuoto all'interno della strumentazione: lo spettrometro di massa infatti lavora ad alto vuoto in modo tale da minimizzare gli urti tra gli ioni di analita generati e altre particelle in fase gas presenti. Se così non fosse gli ioni generati non raggiungerebbero il rivelatore a causa dell'elevata temperatura presente all'interno dello strumento e della reattività intrinseca degli ioni. Per queste ragioni il sistema di introduzione del campione è quindi il punto critico dell'accoppiamento delle due tecniche e deve garantire la corretta introduzione del campione senza compromettere il vuoto del sistema.
 
==Sorgente ionica==
* Hard ionization - la quantità di energia che viene fornita alle molecole di analita è molto elevata. La ionizazzione utilizzata in questo caso è detta ionizzazione elettronica e si ottiene bombardando l'analita con un fascio di elettroni. [[File:Schematic diagram of an EI ion source.jpg|thumb|Sorgente a ionizzazione elettronica]]
* Soft ionization - la quantità di energia che viene fornita alle molecole di analita è sufficiente alla sola ionizzazione. <br>
La '''sorgente a ionizzazione elettronica''' (''EI - Electron Ionization''), può essere applicata solamente a campioni in fase gas, per questo motivo viene solitamente usata nel caso si abbia a che fare con analiti sufficientemente volatili. Il campione viene introdotto perpendicolarmente ad un filamento di tungsteno o rodio il quale emette elettroni perpendicolarmente rispetto alla direzione di avanzamento del campione. Il fascio di energia proveniente dal filamento è solitamente di 70 eV che è una quantità molto più elevata di quella necessaria per la sola ionizzazione del campione. Quando le molecole di analita incontrano il fascio di elettroni ad alta energia si ionizzano a seguito degli urti con gli elettroni e si generano quindi ioni positivi. Gli ioni positivi così generati vengono quindi accelerati da un sistema di lenti a potenziale crescente: in questo modo i cationi vengono spinti verso l'analizzatore mentre i pochi ioni negativi che si sono generati vengono accelerati verso il repeller. Tutte le specie in uscita dalla sorgente hanno energia cinetica per via dell'accelerazione delle lenti a potenziale crescente. <br>
La quantità di anioni che viene generata con questa tipologia di sorgente è molto piccola: la loro formazione è infatti sfavorita e porta ad un rapporto ioni positivi/negativi di circa 10000/1. Per quanto riguarda invece il rapporto tra il numero di molecole inserite e in numero di molecole ionizzate utilizzando un fascio di elettroni di 70 eV questo è di circa 1/1000. La sensibilità dello strumento è comunque ottima. <br>
A causa dell'elevata energia del fascio di elettroni che viene utilizzato, oltre alla ionizzazione si ha anche la frammentazione degli analiti in specie più piccole e il cui schema di frammentazione dipende dalla natura chimica della specie così come la sua tendenza a frammentarsi. Ogni evento di frammentazione da luogo alla formazione di due o più specie chimiche di cui una sola sarà carica, le altre invece saranno neutre: la carica elettrica totale si conserva, per cui solamente la specie carica sarà rivelabile dallo strumento, le specie neutre infatti non raggiungeranno neanche il rivelatore. Frammenti identici formati da percorsi di frammentazione differenti daranno un unico segnale la cui intensità sarà data dalla somma delle intensità dei singoli ioni. <br>
Per eseguire l’analisi si va ad incrementare il valore di tensione continua e alternata applicata in modo tale che il rapporto V<sub>cost</sub> / V<sub>alt</sub> rimanga costante. Con l’opportuna regolazione delle tensioni infatti, viene creato un percorso stabile solamente per ioni aventi un determinato rapporto m/z: questi saranno in grado di descrivere la traiettoria sinusoidale necessaria per arrivare fino al rivelatore , gli altri invece verranno eliminati lungo il percorso in quanto descriveranno oscillazioni di ampiezza via via crescente, per cui procedendo lungo il percorso andranno a collidere contro una delle sbarre costituenti un elettrodo. Lo spettro di massa viene quindi ottenuto scansionando le tensioni che vengono applicate agli elettrodi.
 
Il tempo necessario per eseguire la scansione completa è piuttosto breve, inoltre la capacità di trasmissione è elevata. Uno dei più grandi svantaggi è costituito dal fatto che la risoluzione è piuttosto bassa, il che la rende adatta ad analisi in accoppiata con cromatografia liquida o gas cromatografiagascromatografia, ma non alla rivelazione di ioni con massa superiore ai 1000 Da.
 
'''L’analizzatore a tempo di volo''' (''TOF - Time Of Flight'') è formato da un lungo tubo percorso da ioni precedentemente accelerati da una differenza di potenziale. <br>
Dal momento che l’energia cinetica di uno ione è definita come <math> \frac{mv^2}{2}</math> <br>
ed allo stesso tempo dipende dal potenziale di accelerazione applicato e dalla stessa carica dello ione come descritto dalla seguente equazione <math>q=ze</math>, <br>
 
==Accoppiamento GC-MS==
L'utilizzo dello spettrometro di massa come rivelatore per la gas cromatografiagascromatografia presenta molti vantaggi:
* è estremamente specifico nella selezione di ioni da quantificare;
* è uno dei rivelatori più sensibili in assoluto;
* è estremamente versatile.
L'idea dell'accoppiamento nasce dal fatto che queste due tecniche svolgono funzioni analitiche complementari: la gas cromatografiagascromatografia consente la separazione di miscele complesse mentre la spettrometria di massa consente la caratterizzazione dei composti.
Il problema legato all'accoppiamento di queste due tecniche è legato alla creazione di un'interfaccia tra i due strumenti: innanzitutto la colonna cromatografica lavora sotto pressione mentre lo spettrometro di massa lavora in alto vuoto, il flusso delle colonne cromatografiche, soprattutto quelle impaccate, è molto importante e per niente trascurabile, soprattutto in ambito di cromatografia liquida. Un altro aspetto estremamente importante nasce dalla necessità di operare una scansione molto velocemente: gli analiti devono essere rivelati non appena escono dalla colonna o il rischio è quello di vanificare la separazione, in più l'eventuale spurgo della colonna crea molti problemi. <br>
La prima cosa da fare per creare un'interfaccia adeguata è quella di impoverire il campione proveniente dalla colonna cromatografica di fase mobile in modo da ridurre il flusso in arrivo allo spettrometro di massa, pratica particolarmente importante nel caso di colonne impaccate che utilizzano importanti volumi di fase mobile. Un'interfaccia molto usata prevedeva l'utilizzo di un tubo vetro poroso all'interno del quale veniva fatto passare il flusso in uscita dalla colonna. Il tubo di vetro veniva quindi sottoposto all'esterno all'alto vuoto, il che forzava il gas carrier, solitamente elio, ad uscire dal tubo il quale era dotato di pori di dimensioni tali da permettere solo il passaggio del gas carrier ma non dell'analita: si sfruttava infatti le ridotte dimensioni dell'elio che è il gas carrier più usato. Il problema principale era però dovuto al fatto che una quantità non trascurabile di analita veniva comunque persa (circa il 20-50%).<ref>Grob pag. 346 </ref> Dal momento che si è passati all'impiego di colonne capillari, questa tipologia di interfacce non è più necessaria in quanto queste colonne hanno un flusso che è già abbastanza ridotto da essere compatibile con la portata richiesta dallo spettrometro di massa. L'unica accortezza che va fatta è legata al mantenimento di una temperatura adeguata: si utilizza infatti una piccola sezione di tubo riscaldato al termine della colonna che serve ad evitare la ricondensazione delle sostanze che sono state separate con la cromatografia in modo quindi che si mantengano in fase gas al momento dell'iniezione nello spettrometro, il che causerebbe l'allargamento dei picchi o anche la cattura di sostanze altobollenti che non arriverebbero quindi allo spettrometro di massa.<ref>Grobb pag. 347 </ref><br>
Come in gas cromatografiagascromatografia c'è il rischio della degradazione termica degli analiti, motivo per il quale il controllo termico è di fondamentale importanza: è per questo che la temperatura di iniezione è solitamente non eccessivamente alta. Va inoltre tenuto a mente che gli eventuali prodotti di degradazione termica possono essere identificati durante l'analisi con uno spettrometro di massa. Per prevenire la degradazione termica degli analiti viene solitamente utilizzato l'iniettore on column. <br>
Dal momento che la degradazione di alcune componenti può anche essere causata dalla presenza di gruppi silaniolici della superficie del vetro del liner di iniezione, una buona soluzione è costituita dall'impiego di agenti silanizzanti che convertono i gruppi silaniolici in eteri trimetilsililici.<ref>Grob pag. 347 </ref><br>
Un altro aspetto che va ben tenuto in considerazione al momento dell'accoppiamento di queste due tecniche è legato alla portata del flusso che può essere sopportato dallo spettrometro di massa, il che costituisce un elemento limitante. Questo è solitamente di circa 1 mL/min anche se può essere leggermente più alto se si usano accortezze aggiuntive e particolari. In linea generale vengono quindi impiegate colonne dal diametro da 0,25 mm o tuttalpiù da 0,32 mm, non è però possibile usare colonne megabore in quanto hanno dimensioni eccessive.<ref>Grob pag. 346 </ref>
 
==Esempio di applicazione==
La metodologia analitica che prevede l’accoppiamento GC-MS (''Gas Chromatograhy-Mass Spectrometry'')è, come abbiamo visto nel corso di questo capitolo, una tecnica estremamente efficace nella separazione e determinazione di analiti in matrici anche molto complesse. In questa sezione verrà proposta la costruzione di un metodo analitico che prevede la determinazione quantitativa degli IPA in un campione di sedimento marino utilizzando la tecnica accoppiata GC-MS usando come riferimento il metodo analitico ufficiale dell’ISS. <br>
Gli idrocarburi policiclici aromatici sono prodotti derivati dalla combustione incompleta e la pirolisi di materia organica e la loro determinazione è estremamente importante in quanto 16 di loro presentano attività cancerogena (naftalene, acenaftilene, acenaftene, fluorene, fenantrene, antracene, fluorantene, pirene, benzo[a]antracene, crisene, benzo[a]fluorantene, benzo[k]fluorantene, benzo[a]pirene, indeno[1,2,3-c,d]pirene, dibenzo[a,h]antracene, benzo[g,h,i]perilene). La loro presenza viene monitorata per valutare l’impatto ambientale che i processi umani hanno e per farlo tale analisi viene eseguita su matrici diverse (acqua, sedimenti..). Per prima cosa bisogna andare a definire quelle che sono le condizioni di esercizio per entrambe le tecniche e costruire un’interfaccia che funzioni. <br>
Per quanto riguarda la gas cromatografiagascromatografia si sono usati i seguenti parametri: [[File:Programmata temperatura.png|thumb|Programmata di temperatura]]
* colonna apolare Phenomenex ZB-5 (fenilmetilsilossano al 5%), 30 m x 0,25 mm I.D. x 0,25 micrometri;
* iniettore on-column;
178

contributi