Utente:R5b43/Saggio immunologico: differenze tra le versioni
Contenuto cancellato Contenuto aggiunto
Nessun oggetto della modifica |
|||
Riga 1:
==Western blotting==
[[File:Anti-lipoic_acid_immunoblot.png|thumb|Western blotting per mezzo di anticorpi che usano proteine modificate con [[:it:w:acido lipoico|acido lipoico]]]]
Il '''western blotting''' è una tecnica analitica ampiamente usata per rilevare specifiche proteine in un campione. Usa l'elettroforesi su gel per separare le proteine
Il nome ''western blotting'' è formato sul southern blotting, una tecnica di assorbimento del DNA sviluppata da Edwin Southern. L'assorbimento del RNA si chiama northern blotting.
Riga 10:
===Trasferimento===
Per far sì che le proteine possano essere soggette all'azione degli anticorpi, esse sono trasferite dal gel in una membrana di '''nitrocellulosa''' o
'''polivinilidenfluoruro (PVDF)'''. Il metodo per trasferire le proteine è detto '''electroblotting''' e sfrutta
[[File:Western_blot_transfer.png|center|upright=3]]
Riga 16:
===Bloccaggio===
Poiché la membrana è scelta per la sua capacità di legare le proteine, occorre prevenire legami tra la membrana e l'anticorpo impiegato per il rilevamento della proteina di interesse. L'inibizione dei legami è ottenuta mettendo la membrana in una una soluzione diluita proteica - tipicamente 3-5%
===Rilevamento===
Durante la fase di rilevamento la membrana è saggiata per la proteina di interesse con un anticorpo modificato che è legato a un enzima reporter. Se esposto a un appropriato substrato, questo enzima causa una reazione colorimetrica e produce un colore. Per diverse ragioni, ciò tradizionalmente si sviluppa in due fasi, benché esistano rilevamenti di una sola fase per certe applicazioni.
Nel processo a due fasi, una soluzione diluita dell'anticorpo primario (generalmente tra 0,5 e 5 mg/mL) è incubata colla membrana cui segue una blanda agitazione. Tipicamente, la soluzione è composta di una soluzione tampone salina con una piccola percentuale di detergente, e a volte con latte in polvere o BSA. La soluzione e la membrana possono essere sigillati e incubati assieme da 30 minuti a tutta la notte. Possono essere incubati anche a differenti temperature, con le temperature più alte associate a legami più forti sia specifici (colla proteina di interesse, il "segnale") che aspecifici ("rumore").
Dopo aver risciacquato la membrana per rimuovere gli anticorpi primari non legatisi, la membrana è esposta a un altro anticorpo, diretto a una porzione specifica dell'anticorpo primario. Gli anticorpi provengono da fonti animali. Un anticorpo secondario anti-topo si legherà a quasi ogni anticorpo primario proveniente dal topo. L'anticorpo secondario è solitamente legato alla biotina o a un enzima reporter come la fosfotasi alcalina o la perossidasi di rafano. Ciò significa che numerosi anticorpi secondari si legheranno all'anticorpo primario e incrementeranno il segnale.
| |||