Utente:R5b43/Saggio immunologico: differenze tra le versioni
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===Bloccaggio===
Poiché la membrana è scelta per la sua capacità di legare le proteine, occorre prevenire legami tra la membrana e l'anticorpo impiegato per il rilevamento della proteina di interesse. L'inibizione dei legami è ottenuta mettendo la membrana in una una soluzione diluita proteica - tipicamente 3-5% albumina di siero bovina o latte scremato in polvere in TBS o I-Block, con una piccola percentuale (0,1%) di detergente come Tween 20 o Triton X-100. La proteina della soluzione diluita si lega alla membrana in tutti i punti in cui le proteine non si sono legate. Quindi, quando si aggiunge l'anticorpo, questo non potrà attaccarsi a nessuno spazio della membrana eccetto i siti di legame della proteina di interesse. Ciò elimina i falsi positivi.
===Rilevamento===
During the detection process the membrane is "probed" for the protein of interest with a modified antibody which is linked to a reporter enzyme. When exposed to an appropriate substrate, this enzyme drives a colourimetric reaction and produces a color. For a variety of reasons, this traditionally takes place in a two-step process, although there are now one-step detection methods available for certain applications.
In the two-step process, a dilute solution of primary antibody (generally between 0.5 and 5 micrograms/mL) is incubated with the membrane under gentle agitation. Typically, the solution is composed of buffered saline solution with a small percentage of detergent, and sometimes with powdered milk or BSA. The antibody solution and the membrane can be sealed and incubated together for anywhere from 30 minutes to overnight. It can also be incubated at different temperatures, with higher temperatures being associated with more binding, both specific (to the target protein, the "signal") and non-specific ("noise").
After rinsing the membrane to remove unbound primary antibody, the membrane is exposed to another antibody, directed at a species-specific portion of the primary antibody. Antibodies come from animal sources (or animal sourced hybridoma cultures). An anti-mouse secondary will bind to almost any mouse-sourced primary antibody, which allows some cost savings by allowing an entire lab to share a single source of mass-produced antibody, and provides far more consistent results. The secondary antibody is usually linked to biotin or to a reporter enzyme such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase. This means that several secondary antibodies will bind to one primary antibody and enhance the signal.
Most commonly, a horseradish peroxidase-linked secondary is used to cleave a chemiluminescent agent, and the reaction product produces luminescence in proportion to the amount of protein. A sensitive sheet of photographic film is placed against the membrane, and exposure to the light from the reaction creates an image of the antibodies bound to the blot. A cheaper but less sensitive approach utilizes a 4-chloronaphthol stain with 1% hydrogen peroxide; reaction of peroxide radicals with 4-chloronaphthol produces a dark purple stain that can be photographed without using specialized photographic film.
Durante la fase di rilevamento la membrana è saggiata per la proteina di interesse con un anticorpo modificato che è legato a un enzima reporter. Se esposto a un appropriato substrato, questo enzima causa una reazione colorimetrica e produce un colore. Per diverse ragioni, ciò tradizionalmente si sviluppa in due fasi, benché esistano rilevamenti di una sola fase per certe applicazioni.
Nel processo a due fasi, una soluzione diluita dell'anticorpo primario (generalmente tra 0,5 e 5 mg/mL) è incubata colla membrana cui segue una blanda agitazione. Tipicamente, la soluzione è composta di una soluzione tampone salina con una piccola percentuale di detergente, e a volte con latte in polvere o BSA. La soluzione e la membrana possono essere sigillati e incubati assieme da 30 minuti a tutta la notte. Possono essere incubati anche a differenti temperature, con le temperature più alte associate a legami più forti sia specifici (colla proteina di interesse, il "segnale") che aspecifici ("rumore")
Dopo aver risciacquato la membrana per rimuovere gli anticorpi primari non legatisi, la membrana è esposta a un altro anticorpo, diretto a una porzione specifica dell'anticorpo primario. Gli anticorpi provengono da fonti animali. Un anticorpo secondario anti-topo si legherà a quasi ogni anticorpo primario proveniente dal topo. L'anticorpo secondario è solitamente legato alla biotina o a un enzima reporter come la fosfotasi alcalina o la perossidasi di rafano. Ciò significa che numerosi anticorpi secondari si legheranno all'anticorpo primario e incrementaranno il segnale.
Più comunemente, una perossidasi di rafano legata all'anticorpo secondario è usata per rompere un agente chemioluminescente, e la reazione produce luminescenza in proporzione alla quantità di proteine. Una pellicola fotografica sensibile è posta contro la membrana e l'esposizione alla luce crea un'immagine degli anticorpi legati alla macchia.
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