Utente:R5b43/Saggio immunologico

Western blotting

[[File:Anti-lipoic_acid_immunoblot.png|thumb|Western blotting per mezzo di anticorpi che usano proteine modificate con acido lipoico Il western blotting è una tecnica analitica ampiamente usata per rilevare specifiche proteine in un campione. Usa l'elettroforesi su gel per separare proteine per mezzo della loro struttura tridimensionale o proteine denaturate dalla lunghezza del polipeptide. Le proteine sono quindi trasferite in una membrana (solitamente nitrocellulosa o PVDF), dove sono evidenziate con anticorpi specifici alla proteina di interesse. L'elettroforesi è inclusa nella tecnica del Western blotting per risolvere il problema della reattività tra gli anticorpi. Alcuni motori di ricerca, come CiteAb, possono aiutare i ricercatori a trovare anticorpi adatti al Western blotting.

Il nome western blotting è formato sul southern blotting, una tecnica di assorbimento del DNA sviluppata da Edwin Southern. L'assorbimento del RNA si chiama northern blotting.

Elettroforesi

Le proteine del campione sono separate coll'elettroforesi su gel. La separazione delle prioteine può essere compiuta mediante il punto isoelettrico, massa molecolare, carica elettrica, o una combinazione di questi fattori. SDS-PAGE è di gran lunga il tipo più comun e di elettroforesi. È anche possibile usare un'elettroforesi su gel bidimensionale.

Trasferimento

Per far sì che le proteine possano essere soggette all'azione degli anticorpi, esse sono trasferite dal gel in una membrana di nitrocellulosa o polivinilidenfluoruro (PVDF). Il metodo per trasferire le proteine è detto electroblotting e sfrutta una carica elettrica per far migrare le proteine dal gel alla membrana. Successivamente le proteine sono esposte su su una superfirficie sottile per assorbimento (vedi sotto). Le membrane usate per il trasferimento hanno la peculiarità di legare allo stesso modo le proteine. Il legame colleprotine è basato su interazioni idrofobiche, e anche su interazioni elettrostatiche tra la membrana e le proteine. Le membrane di nitrocellulosa sono meno costose del PVDF, ma sono molto più fragili e non resistono a saggi ripetuti.

Fase del trasferimento

L'uniformità e soprattutto la riuscita del trasferimento delle proteine dal gel alla membrana può essere controllata colorando la menrana con blu di Coomassie o con il rosso di Ponceau. Quest'ultimo è più comune, grazie alle sue maggiori sensibilità e solubilità in acqua, la quale rende più facile decolorare e saggiare la membrana, come descritto sotto.