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Il '''clonaggio''' o '''clonazione molecolare''' è un insieme di metodi sperimentali usati per assemblare molecole di DNA ricombinante e per
Qui l'intero processo è delineato usando l'esempio del clonaggio per restrizione e legatura, che è il metodo tradizionale. Successivamente
==Clonaggio per restrizione e legatura==
Prima degli anni '70, la nostra comprensione della genetica e della biologia molecolare era estremamente ridotta a causa dell'incapacità di isolare e studiare geni di organismi complessi. Ci fu una svolta quando si scoprì che gli enzimi di restrizione e le DNA ligasi erano strumenti utili nella biologia molecolare. Le prime molecole di DNA ricombinante furono create e studiate nel 1972. Il clonaggio per restrizione e legatura divenne presto una procedura standard in biologia molecolare. L'intero processo comprende di solito sette fasi.
===Scelta dell'organismo ospite e del vettore
Sebbene sia usato un gran numero di organismi ospiti e di vettori, la maggior parte delle clonazioni molecolari iniziano con un ceppo di laboratorio di ''E. coli'' e un plasmide come vettore
===Preparazione del vettore===
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===Preparazione del DNA ricombinante===
Per clonare una DNA genomico, il DNA da clonare è estratto dall'organismo di interesse. Teoricamente può essere usato
Il DNA da clonare può essere ottenuto anche dall'RNA coll'impiego della trascrittasi inversa (clonaggio di cDNA), o sottoforma di DNA sintetico (sintesi genica artificiale). Il clonaggio di cDNA è usato
Il DNA purificato è poi trattato con un'enzima di restrizione in modo da generare frammenti le cui estremità siano coesive con quelle
===Trasformazione===
Dopo la manipolazione ''in vitro'' del DNA, il prodotto è solitamente introdotto in ''E. coli'' secondo un processo chiamato trasformazione. Per far sì che la trasformazione avvenga, i batteri devono essere in competizione tra loro. Alcuni batteri mostrano una competizione naturale, in
La superficie di batteri come ''E. coli'' è carica negativamente a causa della presenza in essa
L'elettroporazione è un altro metodo di trasformazione. In questo metodo le cellule sono brevemente sottoposte a un campo elettrico di 10-20 kV/cm che creerebbe i pori tramite i quali i plasmidi possono entrare. Dopo lo shock elettrico i buchi sono subito chiusi dai meccanismi di riparazione della membrana cellulare.
===Selezione===
L'introduzione di DNA ricombinante nell'organismo ospite è solitamente poco efficiente, ossia una piccola parte delle cellule inglobano il DNA. Ciò rende la fase della selezione necessaria, nella quale solo le cellule che hanno
Quando
===Selezionare i cloni corretti===
I moderni vettori batterici (es. pUC19 e derivati successivi tra cui pGEM) usano il sistema di [[:en:w:Blue–white screen|selezione blu-bianco]] per distinguere le colonie di cellule transgeniche che contengono il vettore
Se il vettore non prevede questo sistema, può essere effettuata una ''[[:en:w:Colony PCR|colony PCR]]'' per sapere quali colonie hanno i plasmidi col DNA inserito.
Anche se questi metodi mostrano che il DNA è stato integrato nel vettore, non si può essere sicuri che esso sia la sequenza desiderata. Per questa ragione, dev'essere effettuato il sequenziamento come convalida finale.
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