Utente:R5b43/Clonaggio: differenze tra le versioni
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L'elettroporazione è un altro metodo di trasformazione. In questo metodo le cellule sono brevemente sottoposte a un campo elettrico di 10-20 kV/cm che creerebbe i pori tramite i quali i plasmidi possono entrare. Dopo lo shock elettrico i buchi sono subito chiusi dai meccanismi di riparazione della membrana cellulare.
===Selezione===
L'introduzione di DNA ricombinante nell'organismo ospite è solitamente poco efficiente, ossia una piccola parte delle cellule inglobano il DNA. Ciò rende la fase della selezione necessaria, nella quale solo le cellule che hanno preso le acquisito il DNA col marcatore selettivo sopravvivono.
Quando le cellule batteriche sono usate come organismi ospiti, il marcatore selettivo è solitamente un gene che conferisce resistenza a un antibiotico, tipicamente l'ampicillina. In questa fase si applica la soluzione contenente le cellule trasformate in lastre di agar coll'antibiotico e li si lascia riposare una notte a 37 °C. Le cellule contenenti il plasmide sopravviveranno e formeranno colonie, mentre le cellule che non sono riuscite a inglobare il plasmide moriranno.
===Selezionare i cloni corretti==
I moderni vettori batterici (es. pUC19 e derivati successivi tra cui pGEM) usano il sistema di selezione blu-bianco per distinguere le colonie di cellule transgeniche che contengono il vettore prenatale (cioè vettori senza la sequenza di DNA ricombinante inserita). Perciò è facile identificare i cloni batterici transgenici, ignorando al contempo quelli che non contengono il DNA ricombinante.
Se il vettore non prevede questo sistema, può essere effettuata una ''[[:en:w:Colony PCR|colony PCR]]'' per sapere quali colonie hanno i plasmidi col DNA inserito. Può essere un'altra opzione la restrizione e successiva elettroforesi su gel, che può essere praticata solo se le colonie sono state raccolte, coltivate e i sono stati solati i plasmidi.
Anche se questi metodi mostrano che il DNA è stato integrato nel vettore, non si può essere sicuri che sia la sequenza desiderata. Per questa ragione, dev'essere effettuato il sequenziamento come convalida finale.
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