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Riga 10: ===Preparazione del vettore=== Il vettore è trattato con un'endonucleasi di restrizione per tagliare il DNA nel punto dove il DNA esogeno verrà inserito. L'enzima di restrizione è scelto in modo da avere l'estremità di restrizione compatibile colle estremità del DNA esogeno. Tipicamente, ciò è ottenuto tagliando il vettore e il DNA esogeno collo stesso enzima di restrizione. È importante che l'azione litica dell'enzima sia efficace, altrimenti avremo molte colonie che contengono il vettore originale senza il DNA da clonare inserito. Anche l'unione del vettore col DNA può essere un problema poiché quando le estremità del vettore sono coesive, possono essere legate dalla DNA ligasi e ~~crare~~creare colonie di falsi positivi. Per prevenire ciò, il vettore può essere trattato con una fosfatasi. La DNA ligasi richiede un gruppo fosfato per creare i legami fosfodiesterici, quindi non può unire estremità defosforilate del vettore. In tal caso è necessario che il DNA da inserire porti un gruppo fosfato in posizione 5', che non sarebbe presente se fosse stato ottenuto mediante la PCR. ===Preparazione del DNA ricombinante=== Per clonare una DNA genomico, il DNA da clonare è estratto dall'organismo di interesse. Teoricamente può essere usato qualunque tessuto qualunque tessuto, a patto che il DNA non sia troppo degradato. Il DNA è spesso purificato per rimuovere proteine contaminanti, RNA e piccole molecole. La PCR è spesso usata per amplificare sequenze specifiche di DNA o RNA (RT-PCR) prima del clonaggio. Il DNA da clonare può essere ottenuto anche dall'RNA coll'impiego della trascrittasi inversa (clonaggio di cDNA), o sottoforma di DNA sintetico (sintesi genica artificiale). Il clonaggio di cDNA è usato anche per ottenere cloni di mRNA delle cellule di interesse, mentre il DNA sintetico si usa per ottenere una precisa sequenza desiderata. Il DNA purificato è poi trattato con un'enzima di restrizione in modo da generare frammenti le cui estremità siano coesive con quelle dsel vettore. Se necessario, il sito di restrizione desiderato può essere aggiunto durante la PCR.

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