Utente:R5b43/Clonaggio

Il clonaggio o clonazione molecolare è un insieme di metodi sperimentali usati per assemblare molecole di DNA ricombinante e per permettere la replicazione in un organismo ospite. L'uso della parola "clonaggio" si riferisce al fatto che il metodo consiste nella replicazione di una molecola per produrre una popolazione di cellule con molecole di DNA identiche. Il clonaggio molecolare solitamente usa sequenze di DNA provenienti da due diversi organismi: la specie che è l'origine del DNA da clonare, e le specie che faranno da ospite per la replicazione del DNA ricombinante.

Qui l'intero processo è delineato usando l'esempio del clonaggio per restrizione e legatura, che è il metodo tradizionale. Successivamente, sono descritti strategie speciali e metodi alternativi.

Clonaggio per restrizione e legatura

Prima degli anni '70, la nostra comprensione della genetica e della biologia molecolare era estremamente ridotta a causa dell'incapacità di isolare e studiare geni di organismi complessi. Ci fu una svolta quando si scoprì gli enzimi di restrizione e le DNA ligasi erano strumenti utili nella biologia molecolare. Le prime molecole di DNA ricombinante furono create e studiate nel 1972. Il clonaggio per restrizione e legatura divenne presto una procedura standard in biologia molecolare. L'intero processo comprende di solito sette fasi.

Scelta dell'organismo ospite e del vettore clonante

Sebbene sia usato un gran numero di organismi ospiti e di vettori, la maggior parte delle clonazioni molecolari iniziano con un ceppo di laboratorio di E. coli e un plasmide come vettore clonante. Sono comunemente usati E. coli e i vettori perché sono tecnicamente sofisticati, versatili, ampiamente disponibili e offrono una crescita rapida degli organismo ricombinanti con un equipaggio minimo. Se la molecola dei DNA da clonare è particolarmente grande (centinaia di migliaia di paia di basi), è usato spesso un cromosoma artificiale batterico o del lievito.

Preparazione del vettore

Il vettore è trattato con un'endonucleasi di restrizione per tagliare il DNA nel punto dove il DNA esogeno verrà inserito. L'enzima di restrizione è scelto in modo da avere l'estremità di restrizione compatibile colle estremità del DNA esogeno. Tipicamente, ciò è ottenuto tagliando il vettore e il DNA esogeno collo stesso enzima di restrizione. È importante che l'azione litica dell'enzima sia efficace, altrimenti avremo molte colonie che contengono il vettore originale senza il DNA da clonare inserito. Anche l'unione del vettore col DNA può essere un problema poiché quando le estremità del vettore sono coesive, possono essere legate dalla DNA ligasi e crare colonie di falsi positivi. Per prevenire ciò, il vettore può essere trattato con una fosfatasi. La DNA ligasi richiede un gruppo fosfato per creare i legami fosfodiesterici, quindi non può unire estremità defosforilate del vettore. In tal caso è necessario che il DNA da inserire porti un gruppo fosfato in posizione 5', che non sarebbe presente se fosse stato ottenuto mediante la PCR.